Wie werden Short Tandem Repeats rausgeschnitten?
Beim Restriction Fragment Length Polymorphism werden
DNA-Abschnitte ausgeschnitten durch Restriktionsenzyme
an meist palindromischen Erkennungssequenzen
Die Short Tandem Repeats hingegen fangen nicht an
und enden nicht an Erkennungssequenzen (soweit ich weiß)
Wie sollen sie dann genau rausgeschnitten werden?
1 Antwort
STRs werden nicht herausgeschnitten durch Restriktionsrnzyme. Sie werden ganz einfach durch eine PCR (Polymerasekettenreaktion) amplifiziert. Damit auch wirklich "nur" der Mikrosatellit amplifiziert wird, muss anhand der flankierenden Sequenzen ein spezifisches Primer-Paar (je ein Primer für den Vorwärts- und einer für den Rückwärtsstrang) designed werden. Der Primer bindet dann spezifisch an der flankierenden Stelle und dient der DNA-Polymerade als Startpunkt für die Amplifizierung des jeweils komplementären Strangs. Dabei entstehen natürlich auch Fragmente "falscher" Länge (im ersten Reaktionsschritt hört die Polymerase ja nicht am Ende des STR auf, sondern arbeitet sich munter den Strang entlang weiter vor). Erst im dritten Zyklus entstehen Doppelstränge, die wirklich nur noch den STR beinhalten. In den nachfolgenden Schritten werden die Fragmente gewünschter Länge aber exponentiell vermehrt, da ja jeder Einzelstrang als Matrize dient (aus einem Doppelstrang werden zwei, aus zwei vier, aus vier acht, aus acht 16, aus 16 32, aus 32 64, aus 64 128 usw). Die Fragmente "falscher" Länge werden hingegen nur linear amplifiziert, weil jeweils nur ein Einzelstrang als Matritze dient, sodass die Probe im Wesentlichen am Ende hauptsächlich Fragmente enthält, die nur den STR umfassen.
Mit Hilfe von Multiplex-PCRs können in einem Durchgang auch mehrere STRs amplifiziert werden, wenn mehrere Primer-Paare eingesetzt werden. Voraussetzung dafür ist, dass sich die verschiedenen STRs in ihrer Größe nicht überschneiden , damit die Fragmente später auch richtig zugeordnet werden können. Ein STR könnte z. B. 4 bis 40 bp groß sein, ein anderer 60 bis 120. Wäre der zweite STR etwa 30 bis 60 bp groß, gäbe es eine Überschneidung und man könnte im Ansatz die Fragmente der verschiedenen STRs womöglich nicht mehr auseinander halten.
Oft sind die flankierenden Sequenzen eines Mikrosatelliten bei nahe verwandten Arten ähnlich genug, dass dann ein designtes Primerpaar auch für Untersuchungen bei anderen Arten genutzt werden kann. Ein Promerpaar, das für einen STR beim Menschen designt wurde, wird man jetzt nicht unbedingt bei einem Feuersalamander verwenden können, möglicherweise aber z. B. bei Schimpansen oder Bonobos. Auf die Weise muss man nicht jedes Mal aufwändig erst ein neues Primerpaar basteln, sondern kann in den Veröffentlichungen und Datenbanken schauen, was es bereits gibt und was funktionieren könnte.