Selektion Stempeltechnik Plasmide?
Wie kommt es bei der Transformation von E.coli in Nährlösung zu 3 verschiedenen Ergebnissen (A-C)? PPO sind Trans-Gene
1 Antwort
na ja, man hat ja drei mögliche Bakteriensorten auf dem Nährmedium. Welche, die das Plasmid erhalten haben, in dem auch die Fremd-DNA enthalten ist (A), welche, die das Plasmid erhalten haben, in dem jedoch keine Fremd-DNA enthalten ist (B) und welche, die kein Plasmid erhalten haben (C).
Auf Agar ohne Antibiotikum (Schritt 2) wachsen alle 3 Sorten. Wenn man von denen nun Kolonien auf Agarplatten überstempelt, die Antibiotikum enthalten, können nicht mehr alle Sorten dort wachsen.
Ohne dass ich den Aufbau des Klonierungsvektors nun genau kenne, ist es vermutlich so, dass bei Insertion von Fremd-DNA in den Vektor, diese Stelle genau in einer der beiden Antibiotikaresistenzen liegt. In dem Fall denke ich innerhalb der Tetracyclinresistenz. So dass bei erfolgreichem Einbau von Fremd-DNA in den Vektor eine der beiden Antibiotikaresistenzen, vermutlich also die für Tetracyclin, durch Insertionsinaktivierung verloren geht.
Daraus ergibt sich nun, dass die Kolonien, die in Schritt 3 gegen beide Antibiotika resistent sind, zwar den Klonierungsvektor erhalten haben, die Fremd-DNA jedoch fehlt (B) und die Kolonien, die gegen nur ein Antibiotikum (Ampicillin) resistent und gegen das andere (Tetracyclin) sensitiv sind, den Vektor mitsamt der Fremd-DNA erhalten haben (A). Das wären also genau diese beiden Kolonien:
Sie sind gegen Ampicillin resistent und gegen Tetracyclin sensitiv. Während die anderen beiden, die auch auf Tetracyclin wachsen, nur das nackte Plasmid, ohne Fremd-DNA, erhalten haben (B). So hat man die Kolonien identifiziert, die das Plasmid mit der Fremd-DNA erhalten haben und kann diese weiter verwenden. LG
