Gel-elektrophorese und Sanger - Biologie
Hallo! Haben schon oft auf dieser Seite nützliche Tipps gefunden & mich jetzt letztendlich auch mal entschlossen selbst eine Frage zu stellen, da ich bei einem Thema wirklich verwirrt bin. Hoffe, dass auch mir schnelle & kompetente Antworten zukommen werden :-) Besuche ein Gymnasium, 12. Klasse & die letzte Bioarbeit steht an.
Das Thema, das mich ein wenig verwirrt ist die Gelelektrophorese: Was ich bisher (hoffentlich richtig) verstanden hab : Man braucht ein Stück Dna, das man gerne genauer bestimmen würde. Hierzu ,,zerschneidet" man die Dna mit Restriktionsenzymen, die ja immer an spezifischen Stellen einen Schnitt durchführen. Dadurch hat man dann Stücke in allenmöglichen Längen, von ganz klein bis ganz lang. Dann ist Dna ja wegen dem phosphatrest negativ geladen & die gelelektrophorese läuft mit hilfe von strom ab, also das gel wird elektrisch geladen. dann laufen die dna-stücke das elektrische feld entlang die kleinen weiter und die großen weniger schnell und weniger weit daher liest man das ganze entgegen der laufrichtung ab.
jetzt meine frage : wenn ich letztendlich das plotting durchgeführt habe & sehe: ccccaaaaggggtttt , weil 4 c's am weitesten dann 4 a's dann 4 g's und dann 4t's ist das dann auch die dna,die ich gesucht hab? oder genau das komplementäre stück & ich müsste eigentlich dann ggggttttccccaaaa sagen? dann noch eine frage: wo besteht der unterschied zwischen der sanger-methode und der gelelektrophorese? ich weiss,dass bei sanger mit kettenabbruch nukleotiden gearbeitet wird denen die oh gruppe ( oder so) fehlt. wenn ich dann da auch das plotting durchgeführt habe ist dann mein ergebniss genau das was ich sehe, oder wieder das komplementäre dazu? also ich hab ja dann am ende immer unterschiedlich lange stücke,weil ja immer ein abbruch nukleotid anbindet, bei jeder länge der kette. nächste frage: wie muss ich mir die kettenabbruch methode bei sanger vorstellen? haben ein schaubild bekommen und da sehe ich dann auf dem bild,dass das kürzeste stück nur a ist, da hat dann ja ein ddatp angedockt,dass direkt nach a abbricht bzw. für einen abbruch sorgt. aber wo dockt das an , wenn es ja nur aus a besteht,also das gebilde? habe da glaube ich einige vorstellungsprobleme & auch denkfehler drin und die letzte frage : wo spielen hier gensonden eine rolle? wahrscheinlich bei der gelelektrophorese,falls es stimmt,dass man dann am ende genau die komplementäre basenabfolge für seine dna ablesen sollte. daher bitte ich um schnelle hilfe :) , weil die klausur ja schon bald ansteht
2 Antworten
Hey, also du hast schon einiges richtig verstanden :-) Allerdings noch viel mehr durcheinander geworfen ;-) Also fang ich mal von vorn an. Wir vergessen erstmal Sanger.
Die Gelelektrophorese ist ausschließlich eine Methode um DNA-Fragmente nach ihrer Länge zu trennen. Das hat erstmal nichts mit Restriktionsenzymen oder Sequenzierungen zu tun. Dazu wird, wie du schon gesagt hast, ein Gel (z. B. ein Agarosegel) verwendet. Dieses wird mit Proben (DNA) und einem Marker (DNA-Fragmente mit bekannter Größe als Referenz, z.B. 15 verschiedene in 100 Basenbaar Abständen, also z.B. 100,200, usw.) beladen und in eine Laufkammer gelegt. Diese wird mit einem Puffer befüllt und an eine Stromquelle angeschlossen. Es entsteht dabei ein homogenes elektrisches Feld. Die DNA diffundiert nun (aufgrund der negativen Ladung des Phosphatrückgrats) zum +-Pol. Die unterschiedliche Laufweite kommt daher, dass längere Stücke langsamer durch die Poren des Gels diffundieren als kleinere Stücke, daher laufen kleinere Stücke weiter. Das findet dann bei ganz verschiedenen Dingen Anwendung, z.B. bei Vaterschaftstests oder in der Forensik. Meistens führt man eine Elektrophorese im Anschluss an ein PCR-Experiment durch, als Kontrolle. Ein Plotting ist hierbei nicht unbedingt erforderlich, da man die DNA im Gel anfärben kann, wodurch die Banden detektierbar sind.
Jetzt weiter mit Sanger. Eins schonmal vorweg, hier wird nicht mit Restriktionsenzymen geschnitten! Man hat ein DNA-Stück isoliert und das lässt man auch am Stück. Hierbei geht es jetzt ums Sequenzieren, also um die genaue Nukleotidabfolge und nicht nur um die Größe. Ich versuch mal eine Zusammenfassung zum Thema PCR zu geben, hoffe das passt auch noch alles in die Antwort. Bei der PCR baut ein Enzym (die DNA-Polymerase) einen neuen DNA-Strang auf. Dazu werden neben dem Enzym folgende Dinge benötigt: Eine Template-DNA (sozusagen die Vorlage, bei der Sequenzierung die DNA die du sequenzieren willst), ein Primer (der Startbaustein, ein ca. 20 Basenpaar langes DNA-Stück, bindet immer an der selben Stelle auf deiner Template DNA), NTP's (die Bausteine aus denen DNA besteht) und noch ein paar andere Sachen die hier nicht wichtig sind. Bei der Sanger-Methode verwendet man den Trick mit dem Kettenabbruch. Wenn ein Didesoxynukleotid (ddNTP) anstatt eines normalen NTP's eingebaut wird bricht die Kettenverlängerung irreversibel ab. Das heißt, dass das letzte eingebaute Nukleotid immer das ddNTP ist. Das hilft zunächst wenig, daher sieht der Sequenzierungsansatz folgendermaßen aus:
4 Reaktionsgefäße, in alle 4 kommen alle für die PCR benötigten Teile rein, also die DNA die sequenziert werden soll, Primer, NTP's, Polymerase, etc. Nun haben wir 4 gleiche Ansätze und noch 4 verschiedene ddNTP's: ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP. In jeweils einen Ansatz kommt ein ddNTP rein. Also ein Ansatz mit ddATP, einer mit ddTTP usw. Jetzt läuft die PCR ganz normal ab, nur dass per Zufall die Reaktion immer mal wieder abbricht, nämlich genau dann, wenn ein ddNTP eingebaut wird. Was du mit andocken meinst ist genau dieses einbauen eines ddNTP's in den neu gebildeten DNA-Strang (Also wenn dein DNA Stran so aussieht: TTT, dann kann es sein, dass da ein ddATP eingebaut wird und die Reaktion abbricht). Wenn die ganze Reaktion dann abgelaufen ist trägt man die Ansätze auf ein Gel auf, man verwendet also 4 Bahnen. Jetzt läuft die Trennung nach der Größe ab, wie oben beschrieben. Wenn man jetzt alle 4 Bahnen über einander legt, kann man die Sequenz einfach ablesen. Man fängt also ganz unten, also beim kleinsten, an und schaut zu welchem Ansatz das kleinste Fragment gehört. Dann schaut man nach dem nächst größeren und zu welchem Ansatz das gehört usw. Jeder Ansatz konnte ja immer nur entweder bei A,T,C oder G abbrechen und daher entspricht jede Bahn genau einem der 4 Buchstaben. Das funktioniert, weil die PCR immer an der selben Stelle startet und statistisch gesehen an jeder Stelle in der Sequenz einige Male abbricht.
Jetzt noch zu deinen Fragen.
Ja, was du erhälst ist immer die Komplementäre Sequenz zu derjenigen, die du als Vorlage verwendet hast.
Die Frage hat sich hoffentlich geklärt. Bei der Sequenzierung nach Sanger verwendet man die Gelelektrophorese, die kann man aber auch noch für ganz andere Sachen verwenden.
Gensonden sind kleine DNA-Stücke. Mal angenommen du hast DNA isoliert und willst ein bestimmtes Motiv nachweisen z.B. GGTCCA, dann baust du eine Sonde die komplementär dazu ist und die bindet daran. Wenn man die Sonde dann noch mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, kann man sie auch detektieren.
Ich hoffe das hat dir etwas geholfen, falls du noch Fragen und auch noch Zeit bis zu Klausur hast, schreib einfach ;-)
zusatz: Kann es sein, dass man die sanger-methode sowieso immer durchführt & dann erst die eigentliche gel-elektrophorese? also zuerst die dna stücke,die man durch restriktion erhalten hat in 4 ansätze mit jeweils ddatp oder ,ddttp oder ddgtp oder ddctp enthalten mischen um die fragmente zu erhalten & dann die 4 ansätze in die 4 "bahnen" der elektrophorese geben um das ganze dann noch sichtbar zu machen & rauszufinden wie die reihenfolge genau ist? verwirrt mich irgendwie ziemlich
Harter Stoff für die Tageszeit. Wenn ich morgen Zeit habe und es dich noch interessiert, schaue ich mich ein wenig um. Die Elektrophorese scheint mir jedenfalls nicht den Unterschied auszumachen.