Gelelektrophorese Bestimmung der DNA Sequenz nach Sanger?
Hey Leute, könnt ihr mir die Gelelektrophorese erklären ? Also man hat ja ne DNA Sequenz die unbekannt ist und möchte dann herausfinden welche Basenabfolge sie besitzt. Dann hat man verschiedene unterschiedliche Sequenzen und wirft diese in das Gel. Und durch die unterschiedliche Länge und die unterschiedlichen Ladungen wandern die Sequenzen unterschiedlich weit. Die längeren brauchen länger und sind deswegen oben und die kürzeren siedeln sich weiter unten an, da sie schneller durch das Gel wandern.
Aber wie kann man jetzt anhand dieser Banden auf die Basensequenz schließen? Mir ist das ein Rätsel, da man ja mehrer Sequenzen hat !!!
Bitte um Hilfe !
Gruß Cucks
1 Antwort
Die Gelelektrophorese hast du ja soweit verstanden.
Bei der Sanger Sequenzierung arbeitet man mit "Abbruch-Nucleotiden" (ddNTP), werden diese von der Polymerase an den komplementären Strang gebaut, so kann ab dort kein weiteres Nukleotid angelagert werden, da diesen Nukleotiden die 3'-OH Gruppe fehlt.
Nun erhält man in der Reaktion verschieden lange DNA-Abschnitte, da auch herkömmliche Nucleotide verwendet werden, mit der Gelelektrophorese werden die Abschnitte dann der Länge nach geordnet und man muss in der Auswertung alle Abschnitte miteinandern vergleichen, man kennt dabei immer das letzte Nucleotid und kann so dann letztlich anhand der Länge jedes einzelnen Abschnitts (im Verhältnis zu den Übrigen) auf die Sequenz zurückschließen.
Hier auch nochmal eine kurz Erklärung des Verfahrens: www.dna-sequenzierung.com/sanger-sequenzierung/
Hab ich mir fast gedacht, fand meine erklärung selbst nicht so optimal.
Also du weißt es weil du selbst bestimmst welches Abbruchnucleotid du hinzufügst, du machst immer Wiederholungen, bei denen nur ein Nucleotid also z.B. ddATP verwendet wird, dann machst du das gleiche nochmal mit ddTTP, ddGTP und ddCTP.
Nun vergleichst du die Länge aller Abschnitte miteinandern und sortierst sie von Lang nach kurz, von jedem Abschnitt kennst du, wie schon gesagt, das lezte Nucleotid. Die Sequenz der DNA welche du herausfinden möchtest beginnt dann also mit dem letzten Nucleotid des längsten Abschnittes, geht weiter mit dem letzten Nucleotid des zweitlängsten Abschnittes und endet dann mit dem letzten Nucleotid des kürzesten Abschnittes.
Ich hoffe das war jetzt annähernd verständlich erklärt, die Bilder unter den Links helfen vielleicht noch beim Verständnis.
www.gida.de/testcenter/biologie/bio-dvd040/jpg/14\_Ablauf.jpg
www.esciencecentral.org/ebooks/applications-of-molecular-genetics/images/AMGPM\_DNA-Seq-g002.gif
Blöde Frage, aber woher kenne ich das letzte Nucleotid ist das das Abbruchnucleotid ? Das mit dem Vergleichen verstehe ich immer noch nicht :D