Wofür nutze ich einen Restriktionsverdau mit 2 unterschiedlichen Restriktionsenzymen und anschließender Gelelektrophorese?
Hallo liebe Biochemie-Freunde!
Erstmal etwas zum Versuch an sich: Ich nutze als Probenmaterial Lambda-Phagen-DNA aus E. Coli. Aus diesem Material stelle ich 3 Ansätze her: 1 Ansatz enthält die DNA und die Restriktionsendonuclease XhoI, der 2. Ansatz enthält DNA und Endonuklease EcoRI und im 3. Ansatz gebe ich beide Endonukleasen zur DNA hinzu. Danach mache ich eine Gelelektrophorese.
Warum kombiniere ich denn beide? Wozu brauche ich diesen Versuchsaufbau?
1 Antwort
Hi,
zur Materialauswahl: Die Extraktion von Phagen-DNA ist vergleichsweise einfach, da das Verhältnis von Protein zu DNA bei 1:1 liegt, während dieses Verhältnis bei Bakterien oder anderen Zellen deutlich zugunsten des Proteins verschoben ist. Dazu kommt, dass bei der DNA-Extraktion aus Phagen keine zelluläre Nucleasen bzw. DNAsen auftauchen, die die DNA zerhäckseln, sie also enzymatisch abbauen, bevor man sie weiter untersuchen kann. Die Isolierung hat also den Vorteil, dass sie sauber verläuft und man außer Virusprotein der aufgebrochenen Hüllen, reine DNA erhält und sonst nichts störendes, allenfalls in Spuren.
zum Versuchsansatz: Das Fahren von 3 Versuchsansätzen, von denen in zwei Ansätzen die DNA jeweils mit einem Restriktionsenzym geschnitten wird und in einem weiteren mit beiden und danach eine Gelektrophorese gemacht wird, sieht nach dem Erstellen einer "Restriktionskarte" der DNA aus, um sie grob beurteilen zu können, eine vollständige Sequenzierung wäre eine Feinbeurteilung. Bevor man vollständig sequenzieren kann, muss man sie in kleinere Stücke fragmentieren und eine Restriktionskarte zeigt, wie diese auf dem ganzen DNA-Stück hintereinander liegen.
Dafür spricht auch die Gelektrophorese, die dazu dient, die entstandenen DNA-Fragmente aufzutrennen und anhand von Standardlängenfragmenten, die man mit aufträgt, längenmäßig zu bestimmen.
DNA hat eine negative Nettoladung und wandert im elektrischen Feld zum positiven Pol (zur Anode). Wenn sie veranlasst wird durch eine Gelmatrix zu wandern (häufig Agarose), dann wandern kleine DNA-Stücke aufgrund ihres geringeren Molekulargewichts scheller im elektrischen Feld durch das Gel, als längere (schwerere) DNA-Fragmente. Nach einiger Zeit ist ein Gemisch aus DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge in "Banden" unterschiedlicher Laufgeschwindigkeit auseinandergezogen, wo sich in jeder Bande DNA definierter gleicher Länge befindet. Wenn man Fragmente in einer Spur (meistens am Rand der Elektrophorese-Platte) mitlaufen lässt, deren Länge bekannt ist, kann man die in den Versuchs-Banden enthaltene DNA längenmäßig bestimmen https://de.wikipedia.org/wiki/DNA-Leiter
Aus den gewonnen Fragmenten aus allen 3 Versuchsansätzen kann man dann ggf. Rückschlüsse ziehen, in welcher Reihenfolge sie im ganzen DNA-Strang liegen und eine sog. Restriktionskarte erstellen. Gruß, Cliff