Wie berechnet man die Hybridisierungstemperatur für Primer?
2 Antworten
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Die Tools geben immer an wie die Schmelztemperatur TM berechnet wird.
Hier ist mal ein Beispiel für eine ganz simple Annäherung
http://insilico.ehu.es/tm.php?formula=basic
In der Regel nutzt man allerdings etwas ausgereiftere Tools, deren Formeln weitere Variablen enthalten (benachbarte Basenpaare, Pufferzusammensetzung...).
Für die meisten 0815-Anwendung ist es ohnehin nicht wichtig die exakte TM zu kennen, da eine grobe Näherrung ebenfalls zum Ziel führt.
*EDIT: Ich sehe grade, wenn man das Häkchen bei "Base-Stacking TM" im Link clickt bekommt man auch eine gute Näherung des TM
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Dafür gibt es viel gute Software, aber auch eine komplizierte Formel, die ich allerdings nicht auswendig weiß
Wichtig bei den beiden Primern ist daneben auch, dass ihre 3'-Enden nicht gegenseitig komplementär sind, ob man jetzt 2, 3, 4 Basen "gegeneinanderrutscht". Sonst amplifizieren sich nämlich die Primer selbst, also ohne Zwischensequenz ...
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Ich versuche es mal an einem Beispiel: wenn man so unvorsichtig wäre, die beiden Primer als:
Primer 1 = 5'-GACTTAGATTCGTCAGTTAGATC-3' und
Primer 2 = 5'-TTATGTAGGCCGTACGTAGTCGA-3'
auszuwählen, dann sind das TC am Ende von Primer 1 und das GA von Primer 2 komplementär. da das T (vorletzte Base von Primer1) mit dem A (letzte Base von Primer 2) paaren kann und das C (letzte Base von Primer 1) mit dem G (vorletzte Base von Primer 2)
Denn die Primer lagern sich dann wie folgt aneinander:
5'-GACTTAGATTCGTCAGTTAGATC-3'................................................
..................................................3'-AGCTGATGCATGCCGGATGTATT-5'
und dann werden von den 3'-Enden aus die beiden Primer vervollständigt, es entstünde also der folgende Doppelstrang:
5'-GACTTAGATTCGTCAGTTAGATCGACTACGTACGGCCTACATAA-3'
3'-CTGAATCTAAGCAGTCAATCTAGCTGATGCATGCCGGATGTATT-5'
Dann binden in der nächsten Ampplifizierungsrunde die beiden Primer wieder und die "Doppel-Primer-Sequenz" wird ein weiteres mal verdoppelt.
Viele Grüße, gruenefeder
Kannst du noch mal dieses "amplifizieren" erläutern bzw was genau bedeutet das für das PCR wenn die Primer komplementär sind?