Bakterienplasmide ... Zusammenfassung
Das Arbeitsblatt haben wir vor einigen Wochen in der Schule bearbeitet. Nun haben wir Ferien und ich wollte alles zusammenfassen, allerdings verstehe ich nicht alles. Könnt ihr mir helfen? Hab bisher geschrieben:
"Das auf dem Plasmid liegende Ampicillin-Resistenzgen wird von der Pst 1 Restriktionsendonuclease aufgetrennt. Dann wird die Fremd-DNA zwischen die getrennten Ampicillin-Resistenzgene hinzugefügt. Das Plasmid mit der Fremd-DNA wird danach in die Bakterienzelle eingepflanzt, die dann zwei Plasmide besitzt."
Was ich beispielsweise nicht verstehe: "Die Plasmide werden unabhängig vom Chromosom repliziert." Die Plasmide sind doch die Chromosomen, oder nicht?
3 Antworten
Die Plasmide sind nicht die Chromosomen, sondern noch zusätzlich vorhandene DNA in der Bakterienzelle.
Falls sich jemand das Gleiche fragt, hab die Antwort nun drauf:
Transformation: Das Plasmid Pbr322 enthält zwei Resistenzgene, und zwar gegen die Antibiotika Tetracyclin und Ampicillin. Das auf dem Plasmid liegende Ampicillin-Resistenzgen wird von der Pst 1 Restriktionsendonuclease aufgetrennt, wenn man diese hinzugefügt. Die Fremd-DNA (Vektor-DNA), die zwischen die getrennten Ampicillin-Resistenzgene eingebaut wird, macht das Resistenzgen „unlesbar“. Die Plasmide ohne Fremd-DNA enthalten weiterhin jeweils ein intaktes Ampicillin-Gen. Durch die Zugabe von DNA-Ligase werden alle Plasmide geschlossen. Anschließend werden die E-coli-Zellen mit dem Plasmidgemisch transformiert.
Selektion: Die Zellen, die ein Plasmid aufgenommen haben, werden ausgelesen und danach müssen die Zellen identifiziert werden, deren Plasmid die Fremd-DNA enthält.
Die Bakterien werden im ersten Schritt auf einem Nährboden, der das Antibiotikum Tetracyclin enthält, kultiviert. Die Zellen, die kein Plasmid aufgenommen haben, gehen zugrunde, während die Zellen mit Plasmid aufgrund der Tetracyclin-Resistenz zu Kolonien heranwachsen. Mithilfe eines Samtstempels überträgt man eine „Kopie“ der Kolonien auf einen zweiten Nährboden, der das Antibiotikum Ampicillin enthält. Da auf einem Nährboden mit Ampicilin nur Bakterien ohne Fremd-DNA zu Kolonien heranwachsen, können durch Vergleich mit dem ersten Nährboden die Kolonien identifiziert werden, die von transformierten Bakterien stammen.
Heute benutzt man bevorzugt Markergene, die für fluoreszierende Proteine codieren. Pipettier-Roboter erkennen die fluoreszierenden Kulturen und wählen sie aus
Dann habe ich noch vorhin geschrieben: " Die Bakterienzelle wird vermehrt und in eine Petrischale mit Tetrazyklin übertragen. Da die Bakterien nicht abgetötet werden, erkennt man, dass sie durch die Fremd-DNA resistent gegen Tetrazyklin geworden sind. Stempelt man die Bakterien in eine Petrischale mit Ampicillin, stellt man fest, dass nur noch wenige Bakterien vorhanden sind, d.h. sie sind nicht resistent gegen Ampicillin. "