DNA-Hybridisierung, wie wird verhindert, dass sich die DNA Einzelstränge einer DNA verbinden?
Hallo,
ich muss morgen für Biologie ein Referat machen und bin das heute noch mal durchgegangen und habe plötzlich gemerkt, dass ich nicht weiß, wie verhidert wird, dass sich bei der DNA-Hybridisierung die beiden DNA-Einzelstränge einer DNA wieder zusammen fügen?
Es ist ja so, dass die DNA erhitzt wird und sich die Wasserstoffbrückenbindungen trennen ud dann sollen sich zwei verschiedene Einzelstränge anlagern, so da liegt das Problem, wie wird verhindert, dass sich nicht die Einzelstränge einer DNA anlagern?
Irgendwo habe ich gelesen, dass mi radioaktiven Makern gearbeitet wird, aber ich weiß nicht in wie weit das stimmt. Auf den meisten seriösen Seiten stand von diesem Problem nicht. Ich habe grade fürchterliche Angst, dass mich jemand fragt, wie es verhindert wird und ich keine Antwort auf die Frage habe...
3 Antworten
Deine Frage ist auf jeden Fall berechtigt. Die Technik der DNA-Hybridisierung, die du beschreibst, ist, wenn ich mich jetzt nicht täusche, immer noch mit anderen Techniken/Methoden gekoppelt. Ich habe mir mal folgende Gedanken gemacht, wie man ein solches Experiment durchführen könnte:
Du hast eine DNA A und eine DNA B, die du auf mögliche Gemeinsamkeiten in der Sequenz untersuchen willst. Im ersten Schritt denaturierst du beide DNA in einem Reaktionsansatz durch Temperaturerhöhung. Dann wird gut geschüttelt und gewartet bis sich komplementäre Stränge wieder zusammengefügt haben. Natürlich lagern sich jetzt auch die beiden Einzelstränge von A und B wieder zusammen. Es kommt aber auch zu DNA Hybriden aus A und B (wie viele, ist Statistik).
Der Unterschied zwischen AB-Hybrid und AA-/ BB-Hybrid ist der, dass AB weniger Basenpaarungen aufweist, als AA oder BB und somit ist die Schmelztemperatur niedriger (weniger H-Brücken). Wenn du also erneut denaturierst, wirst du bei geringeren Temperaturen, als vorher, Einzelstränge beobachten. Klar?
Mittels Fluoreszenzfarbstoffen, die mit der doppelsträngigen DNA (dsDNA) interkalieren, lassen sich dann Einzelstränge nachweisen. Es gibt Farbstoffe, die nur fluoreszieren, wenn sie mit dsDNA interkalieren. Sobald Einzelstränge entstehen, hört die Fluoreszenz auf, was detektiert werden kann, was - wie bereits gesagt - bei den AB-Hydriden früher (niederer Temperatur) der Fall ist.
Verstanden?
LG
Hab's auch verstanden. Was es nicht alles gibt (komme ursprünglich aus nem "Spar-Labor").
Super, was man noch alles lernen kann :)
Es gibt Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. sybr Green), die sich in dsDNA einlagern und nur dann fluoreszieren.
Nach deiner Hybridisierung hast du ausschließlich dsDNA (AA, BB, AB), die fluoresziert. Wenn du jetzt langsam die Temperatur erhöhst, kommt es zur erneuten Denaturierung und der Farbstoff wird abgegeben. Da AB schneller in Einzelstränge zerlegt wird, bekommst du bei einer Temperatur T1 ein Abfall des Fluoreszenzsignals (AB Hybride). Nach einer weiteren Temperaturerhöhung (T2), kommt es erneut zu einem Abfall des Fluoreszenzsignals (AA und BB Hybride).
Trägt man das Fluoreszenzsignal gegen die Temperatur auf, so bekommst du eine Kurve, die bei zwei Temperaturen (T1 und T2) abfällt.
Wenn du bspw. keine DNA-Hybride hast, siehst du in der Kurve nur ein Abfall, weil jede dsDNA die gleiche Schmelztemperatur hat.
Ist bisschen schwierig zu beschreiben, aber ich hoffe du kannst mir folgen ;-)
LG
ja ich glaube ich habe es jetzt verstanden. Also eigentlich war ja dir Frage, ob man es verhindern kann, dass sich AA wieder zu Aa lagert. Das geht also nicht?
Und das Erkennen, ob AA/AB/BA zusammen ist, funktioniert mit der Fluroreszenz.
Genau! Verhindern kann man das nicht, nein... Es sei denn man schafft es, die denaturierten Einzelstränge unwiderruflich zu trennen. Wie das gehen könnte, kann ich dir jetzt salopp nicht sagen.
Grüße
Bei der Denaturation der Probe trennen sich die Einzelstraenge durch Erhitzung und man markiert sie z.B. mir radioaktiven Markern. Wenn die Mischung abkuehlt, fuegen sie sich wieder zusammen, und die komplimentaeren Einzelstraenge, die nicht markiert wurden, uebernehm,en die Radioaktivitaet der markierten.
Wenn man das vermeiden will, muss man die Mischung nicht abkuehlen lassen.
es sollen sich ja eben nicht die gleichen zusammenfügen!
Nicht komplimentaere koennen sich aber nicht zusammenfuegen...
wenn du 2 DNA fragmente hast dun diese teilst hast du 4 Einzelstränge von denen jeweils zwei komplementär sind und es sollen eben zwei verschiedene zusammen kommen
Sagen wir mal du hast DNA A. das Hast du die Einzelstränge a und a und du hast die DNA B mit den Einzelsträngen b und b. Es sollen sich a und b zusammen fügen. Wie wird verhindert, dass sich nicht wieder a und a und b und b fügen?
Achso, jetzt verstehe ich was du meinst. Wenn die Mischung noch heiss ist, kann man viel fremde DNA dazugeben und beim Abkuehlen werden sich viele der Staenge mit den neuen Straengen paaren.
Ob sich die Einzelstraenge nun mit ihren "Originalpartnern" paaren oder mit der fremden DNA ist eine Sache der Wahrscheinlichkeit - gibst du viel fremde DNA dazu, werden sich auch viele der Originalstraenge mit den fremden paaren.
Da diese Verbindungen weniger stabil sind (weiniger Wasserstoffbrückenbindungen), wird diese neue Mischung bei einer niedrigeren Temperatur "schmelzen", und das ist ein guter Indikator wenn man DNA von verschiedenen Spezies vergleichen will (wie sehr sind sie verwandt).
danke ich hätte vielleicht dazu schreiben sollen, dass es sich um die Belege der evolution handelt. Also ist es sicher, dass es keine genaue Methode gibt, dass sich die DNA zweier Arten mischt?
Erstmal, die Methode ist relativ genau :-)
Ob die Original DNA das Ergebnis verfaelscht... okay, ich sehe das Problem.
Aber ueberleg mal welche moeglichen Basenpaare es gibt (A mit T, C mit G), das geht gar nicht oder ist zumindendest waere so eine Verbindung sehr unstabil, weil nicht viele Verbindungen korrekt waeren. Nimm in Betracht, dass eine Probe 100-1000 Basen hat
Ich vermute (weiss nicht), dass solche Fehler statistisch passieren und mit in Rechnung genommen werden.
Vielleicht hilft dass dir, ist aber auf Englisch: http://personal.uncc.edu/jmarks/DNAHYB/dnahyb1.html
Ich gehe jetzt mal von einer PCR aus: durch die hohe Temperatur denaturiert die DNA. Kühlt sie nicht ab, bleibt das auch so. Generell ist es aber so, dass die viel zu lang ist, um wieder "vernünftig" zu renaturieren. Bei einer niedrigeren Temperatur können nun Primer - also kürzere DNA Stücke binden. Sie tun das ebenfalls bevorzugt, denn im Vergleich zur DNA sind sie im Überschuss in der Probe. Noch dazu mit etwa 20bp recht kurz. Auch einzelne Nukleotide können durch ihre Größe viel besser binden (das macht aber ein Enzym).
das hat mit der PCR nichts zu tun. Es geht um die Belge der Evolution. Dabei wird beispielsweise Schimpansen DNA mit der des Menschens verglichen. IN dem die menschliche NA getrennt wir und die des Schimpansen und sich dann die Menschen und Schimpansen DNA renauturieren...
danke scho mal für die Antwort!
Was ich jetzt noch nicht ganz verstehe ist der Teil:
wird dann fluroeziert, wenn sich die Doppelsträngeiner DNA anlagern?
Mein Ziel ist es ja, dass sich zwei verschiedene anlagern. Wenn ich das Ziel erreicht habe fluroreziert es nicht?