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Die Augenfarbe wird durch Pigmente in der Eigenschicht (Stroma) der Regenbogenhaut (lat. Iris) bestimmt. Sie ist das Resultat komplexer Prozesse, an denen mehrere Gene beteiligt sind.
Der Grundton bei Menschen europäischer Abstammung ist meistens blau, hier ist das Stroma der Iris weitestgehend unpigmentiert und die Färbung kommt durch die dünne Pigmentschicht (Epithelium pigmentosum) auf der Hinterseite der Iris zustande. Dies zeigt sich besonders bei Babys, die meist blaue Augen haben, da bei ihnen der Farbstoff Melanin, der für die Färbung der Pigmente verantwortlich ist, kaum vorhanden ist. Die eigentliche Augenfarbe entsteht beim Menschen erst am Ende des ersten Lebensjahres und kann sich im Laufe der Pubertät noch verändern. Blaue Augen haben auch verschiedene Katzenrassen (z. B. Perserkatzen) und einige wenige Hunderassen.
Durch Einlagerung des braunfärbenden Melanins in die Iriseigenschicht bildet sich eine charakteristische Augenfarbe, die in Abhängigkeit von der Pigmentmenge über grau, gelb, grün bis braun, bei entsprechend hoher Menge von Melanin sogar bis hin zu schwarz, reicht. Dieses korreliert beim Menschen meist mit der Haut- und Haarfarbe. So besitzen hellhäutige und blonde Menschen eher blaue Augen, während dunkelhäutige mit dunklen Haaren meist eine braune Irisfärbung aufweisen. Dazu ist außerdem zu sagen, dass der Hautton nur schwach kausal von den Allelen (Genvarianten) für die Augen- und Haarfarbe beeinflusst wird, abgesehen von jenen Allelen für blaue Augen und rote Haare, welche eine Aufhellung des Hauttones bewirken.
Selten kann es vorkommen, dass sich nur in einem Auge Pigmente einlagern (Iris-Heterochromie). Dann besitzt die Person unterschiedliche Augenfarben (meist grün und blau). Auch kann man beobachten, dass die Augenfarbe mit der Sonneneinstrahlung zusammen hängt. Menschen in der Arktis haben meist blaue Augen, da dort kaum direkte Sonneneinstrahlung herrscht. Braune Färbungen der Iris sind für viele Säugetiere typisch.
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