Sequenzierung?

Wir haben gerade das Thema der Sequenzierung nun frage ich mich:

Warum muss die DNA bei der Sequenzierreaktion und bei der Polyacrylamidgelelektrophorese einzelsträngig vorliegen ? und Wie wird dies überhaupt erreicht?

Answer 1

[Darwinist]

Ich nehme mal an, es geht beim Sequencing um die Kettenabbruchmethode nach Sanger?

Im Prinzip passiert dabei das gleiche wie bei einer "normalen" PCR. Die DNA wird durch Hitze in die Einzelstränge aufgeschmolzen, eine Polymerase bastelt daraufhin den komplementären Strang. Weil aber zusätzlich neben den normalen Desoxynukleotiden auch Di-Desoxynukleotide in den Reaktionsansatz gegeben werden, wird die Synthese des Strangs jedes Mal, wenn zufälligerweise ein Di-Desoxynukleotid eingebaut wird, die Synthese des Strangs abgebrochen (die DNA-Polymerase braucht zum Anheften eines weiteren Nukleotids immer ein freies 3'-OH und das fehlt den Di-Desoxynukleotiden. Auf die Weise entstehen unterschiedlich lange DNA-Fragmente, die in einer Gelelektrophorese der Größe nach aufgetrennt werden können. Früher brauchte man für jedes der Nukleotide (A, G, T, C) einen separaten Reaktionsansatz. Dank einer Vielzahl verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe genügt heute ein einzelner.

Woher ich das weiß: Studium / Ausbildung – Biologiestudium, Universität Leipzig

Comments

[kolapi]

Danke! Ja genau, aber warum muss die DNA einzelsträngig sein? Damit sich dann die Primer anlagern können?

[Darwinist]

@kolapi

Weil die Amplifikation logischerweise nur so funktioniert. Wo sollen denn die Primer binden und die Polymerase den komplementären Strang aufbauen, wenn die DNA als Doppelstrang vorliegt? ;-)